© Los autores, 2022. Publicado por la Revista de Innovación y Transferencia Productiva

ISSN: 2810-8027 (En línea)                                                  

 

Volumen 3, Número 1

Enero-Junio | 2022

e003
https://doi.org/10.54353/ritp.v3i1.e003

 

ARTÍCULO ORIGINAL
 

 


Validación de un método multiresiduos en UHPLC- MS/MS para la determinación de diez residuos de antibióticos veterinarios en Oncorhynchus mykiss

Validation of a multi-residue method in UHPLC-MS/MS for determination of ten veterinary antibiotic residues in Oncorhynchus mykiss

Nathaly Hurtado ORCID 1a*, Diego Chirinos ORCID 2,3 b, Yenka Flores  ORCID 4c, Diana OchoaORCID 1,4d, Luis Huicho ORCID 4,5,6 e y Maria Rivera-Chira  ORCID 1,3,4 f


1 Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

2 Laboratorio de Control de Calidad y Seguridad Alimentaria (LACCSA), Centro de Innovación Productiva y Transferencia Tecnológica Privado Acuícola de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (CITEacuícola UPCH), Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

3 Centro de Innovación Productiva y Transferencia Tecnológica Privado Acuícola de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (CITEacuícola UPCH), Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

4 Centro de Investigación para el Desarrollo Integral y Sostenible (CIDIS), Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

 5 Centro de Investigación en Salud Materna e Infantil, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

6 Facultad de Medicina “Alberto Hurtado”, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

a nathaly.hurtado.g@upch.pe, b diegochpa@gmail.com, c yenka.flores@upch.pe, d diana.ochoa@upch.pe, e lhuicho@gmail.com, f maria.rivera.c@upch.pe

* Autor de correspondencia

 

| Recibido: 16/03/22  |

| Arbitrado por pares |

| Aceptado:23/06/22  |

 

 

Resumen

En el Perú existen protocolos regulados para la vigilancia de los residuos antibióticos en el área alimentaria. No obstante, otros rubros como el sector acuícola, que están en continuo crecimiento, no cuentan con controles de vigilancia rutinarios a pesar del uso de antibióticos en los productos de cultivo. La falta de control se debe e21|n parte a que el ente regulador peruano (Organismo Nacional de Sanidad Pesquera SANIPES) no cuenta con ensayos validados, regulados o aceptados para determinar y cuantificar la presencia de residuos veterinarios en productos acuícolas. Por ende, con el objetivo de identificar y determinar si estos residuos se hallan dentro del límite máximo permitido de acuerdo a la regulación nacional, se validó un método de multiresiduos de 10 antibióticos mediante la técnica de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a la espectrometría de masas de triple cuadrupolo (UHPLC-MS/MS) evaluado en la trucha arcoíris, el producto acuícola de mayor producción nacional. La validación incluyó los parámetros de selectividad, linealidad, sensibilidad, límite de detección, límite de cuantificación, recuperación y precisión, basándose en los criterios de aceptabilidad de la guía de validación de métodos químicos del Programa de Alimentos y Medicina Veterinaria de la Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA). Con el método validado, se analizaron los niveles de residuos de antibióticos en muestras de trucha arcoíris adquiridas al azar en 6 diferentes mercados de Lima Norte (Los Olivos, Independencia, Comas, Puente Piedra, San Martín). Se verificó una adecuada selectividad, menor al 13.82%; una linealidad con valores mayores de 0.99; una sensibilidad con tendencia vertical para la mayoría de los antibióticos; límites de detección y cuantificación menores de 1.994 µg/kg y 6.647 µg/kg, respectivamente; una recuperación dentro del rango de 90% a 115% y una precisión menor del 9%. Finalmente, se detectó trazas de oxitetraciclina en una de las muestras de mercado. El método demostró ser adecuado para la determinación de 10 residuos antibióticos, constituyendo una alternativa útil para el monitoreo de residuos de antibióticos en productos acuícolas.

 

 

Palabras clave: oncorhynchus mykiss; residuos antibióticos, UHPLC/MS/MS, regulación sanitaria

 

 

Abstract

In Peru there are regulated protocols for monitoring antibiotic residues in the food industry. However, the aquaculture sector, in continued growth, does not have routine monitoring checks, although the use of antibiotics in aquaculture products is common. The lack of monitoring is partly due to the fact that the Peruvian regulatory body (National Fisheries Health Agency [Organismo Nacional de Sanidad Pesquera, SANIPES]) does not have validated, regulated or accepted tests to determine and quantify the presence of veterinary residues in aquaculture products. Therefore, to identify and determine if the residues are within the maximum limit allowed by national regulations, we aimed to validate a multiresidue method of 10 antibiotics through the ultra-high performance liquid chromatography coupled to a triple quadrupole mass spectrometric (UHPLC-MS/MS), assessed in rainbow trout that is the aquaculture product with the highest national production. The validation includes parameters of selectivity, linearity, sensitivity, detection limit, quantification limit, recovery range and precision, based on the acceptability criteria of the chemical method validation guide of the Food and Veterinary Medicine Program of the Food and Drug Administration of the United States (FDA). After the validation of the method, the levels of antibiotic residues in rainbow trout samples acquired at random in 6 different markets in North Lima (Los Olivos, Independencia, Comas, Puente Piedra, San Martin) were analyzed. The method showed an adequate selectivity, lower than 13.82%; a linearity with values ​​greater than 0.99; a sensitivity with a vertical trend for most antibiotics; detection and quantification limits lower than 1,994 µg/kg and 6,647 µg/kg, respectively; a recovery within the range of 90% to 115% and an accuracy of less than 9%. Traces of oxytetracycline were detected in one of the market samples. The method proved to be adequate for the determination of 10 antibiotic residues, being a useful alternative for monitoring aquaculture products.

 

 

Keywords: oncorhynchus mykiss; antibiotic residues, UHPLC-MS/MS, sanitary regulation

 

 

 

Introducción

 

En el Perú, el consumo y exportación de los productos acuícolas y en especial de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) han aumentado a lo largo de esta última década, como lo demuestra el anuario estadístico del Ministerio de la Producción (Ministerio de la Producción del Perú, 2021). Al ser un producto de consumo humano, la trucha arcoíris requiere pasar por diversos controles de calidad que aseguren su inocuidad y el cumplimiento de las regulaciones sanitarias correspondientes. Entre los que se realizan a los productos acuícolas se encuentran los ensayos de detección del nivel de residuos de medicamentos, según se describe en el procedimiento del Programa de Control de Sustancias y Residuos (PCSR) (SANIPES, 2017). Aunque, el PCSR no especifica un cronograma de recolección de muestras para el análisis de estas sustancias, explica que se debe extraer el 1% de la producción anual para tal propósito (SANIPES, 2017). Por tanto, el análisis del 1% no se realiza por empresa productora, sino en relación a la producción anual de cada tipo de pez (SANIPES, 2017). En el contexto de la realidad pesquera del país, es probable la presencia de múltiples lotes de productos no analizados. Adicionalmente, SANIPES, encargado de normar, supervisar y fiscalizar la sanidad e inocuidad en toda la cadena productiva de los alimentos, aditivos y productos pesqueros y acuícolas, sólo cuenta con un método validado y aceptado, basado en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa en tándem, exclusivo para medicamentos antihelmínticos, por lo que el resto de sustancias controladas deben ser analizadas en laboratorios extranjeros o resultan postergadas (SANIPES, s.f.). Esta situación es indeseable desde el punto de vista de salud pública, considerando que las enfermedades más comunes que padecen los peces en el país, según reporta el propio SANIPES, son producidas por bacterias (SANIPES, 2016). Estudios similares sobre patologías en truchas arcoíris coinciden con esta conclusión (Mendoza & Palomino, 2004; Montesinos, 2018; Fernández, 2013; León et al., 2008; Fernando et al., 2019). En consecuencia, urge desarrollar y certificar nuevos análisis que permitan evaluar cuantitativamente la inocuidad de las especies en la cadena productiva, incluyendo aditivos (tales como acondicionadores y desinfectantes) y medicamentos (tales como antibióticos). La implementación sistemática de este tipo de métodos permitiría la adecuada supervisión de medicamentos y productos de consumo, lo cual se convertiría en un sello de calidad y garantía de que los productos nacionales cumplen con la regulación nacional e internacional vigente.

 

La técnica analítica de cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo, denominado en inglés Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS), es internacionalmente considerada como una técnica altamente sensible y selectiva y además es de uso estándar para la detección de todo tipo de análisis de residuos antimicrobianos (Mainero et al., 2017; FSIS, 2018). El servicio de seguridad e inspección alimentaria (FSIS) de los Estados Unidos tiene un procedimiento oficial para más de 90 antimicrobianos usando esta técnica analítica (FSIS, 2018). Esta técnica es utilizada incluso en productos acuícolas como el salmón, la trucha, el bagre, la corvina, la tilapia y otras especies, habiéndose desarrollado métodos para determinar grupos de analitos con 14 a más antibióticos diferentes en un solo análisis (Rocha et al., 2017; Santos et al., 2019; Tao, 2020). Estos antecedentes muestran la necesidad de la implementación de técnicas similares en el país y abren el paso para el establecimiento de métodos confiables de cuantificación de residuos de antibióticos en productos acuícolas, incluida la trucha arcoíris, de modo que se tenga un mejor control de la inocuidad de los productos hidrobiológicos antes de su consumo dentro y fuera del país. En tal sentido, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar y validar una metodología analítica para la determinación de diez residuos de antibióticos veterinarios en Oncorhynchus mykiss, utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a un detector de masas de triple cuadrupolo y probar el método en muestras de mercado que van directo al consumidor.

 

 

 

 

Materiales y métodos

 

Obtención y preparación de muestras

Se obtuvieron muestras de trucha arcoíris libres de residuos antibióticos de una empresa local de Pasco dedicada a la acuicultura (ver Apéndice 1), las que se mantuvieron protegidas de la luz y fueron almacenadas a -18 °C hasta la preparación para el análisis. La preparación de las muestras siguió las pautas de los estudios de investigación del método oficial del FSIS de los Estados Unidos, con optimizaciones para el presente estudio (FSIS, 2018; Geis-Asteggiante et al., 2012), según se describe a continuación.

Las muestras de truchas fueron descongeladas a temperatura ambiente y troceadas para obtener sólo fragmentos de músculo con piel y fueron posteriormente molidas utilizando el homogenizador Robocouper®). A partir de este homogenizado se pesaron aproximadamente 2.00 g de músculo de trucha en tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL y se realizó la fortificación para las pruebas de validación, con el agregado de 10 mL de una solución de acetonitrilo: EDTA 0.1 M con 0.1% de ácido fórmico (4:1 v/v). Posteriormente se homogenizó la mezcla con un equipo vórtex por 5 minutos y se centrifugó a 5000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se trasvasó a un tubo de 50 mL conteniendo 500 mg de adsorbente C18, se adicionaron 10 mL de Hexano, se agitó por 30 segundos y se procedió a centrifugar nuevamente a 5000 rpm por 10 minutos. A continuación, se eliminó la capa de hexano con una pipeta Pasteur y se transfirieron 5 mL del sobrenadante remanente a un tubo de centrífuga de polipropileno de 10 mL. El extracto se concentró hasta la sequedad en un equipo de evaporador de nitrógeno a 50 °C. El concentrado seco fue reconstituido con 1 mL de acetonitrilo (ácido fórmico al 0.1 % en agua (1:9 v/v)) y se filtró a través de filtros PDVF de 0.2 µm en viales de color ámbar. Finalmente, se inyectaron 2 µL en el equipo UHPLC-MS/MS Acquity Xevo TQ-XS (Waters®), del Laboratorio de Control de Calidad y Seguridad Alimentaria del CITEacuícola UPCH, en la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

 

Estándares y reactivos

Los estándares utilizados en el estudio fueron los siguientes: enrofloxacino (99.8%, Sigma Aldrich), hidrato de hidrocloruro de ciprofloxacino (99.7%, Sigma Aldrich), ácido oxolínico (99%, Sigma Aldrich), amoxicilina trihidratada (98.74%, Dr. Ehrenstorfer), oxitetraciclina dihidratada (99.9%, Sigma Aldrich), hidrocloruro de clortetraciclina (93.3%, Sigma Aldrich), hidrocloruro de tetraciclina (97.5%, Sigma Aldrich), sulfadoxina (98.9%, Sigma Aldrich), sulfadimetoxina (99.6%, Sigma Aldrich) y florfenicol (99%, Sigma Aldrich).

Los reactivos utilizados fueron de grado LC-MS/MS o HPLC. Metanol (Sigma Aldrich), acetonitrilo (Merck), hexano (Merck), ácido fórmico (Honeywell Fluka), hidróxido de sodio (EMSURE), EDTA sal disódica (Merck), adsorbente C18 (Sigma Aldrich) y agua ultrapura del equipo Milipore Mili-Q system (Milford, MA, USA).

La primera dilución stock sigue las pautas de los estudios del FSIS para su dilución y conservación (FSIS, 2018; Geis-Asteggiante et al., 2012). Los estándares se llevan a una concentración de 1000 ppm (Soluciones Stock) de cada uno de los 10 estándares de antibióticos, los cuales fueron preparados disolviendo una cantidad apropiada de cada estándar primario en disolventes como acetonitrilo, metanol, 0.03 M de NaOH o agua ultrapura (para los betalactámicos). Las soluciones fueron almacenadas a -18° C en la oscuridad. Las soluciones estándares para la sintonización de los antibióticos fueron de 0.01 ppm y se prepararon realizando dos diluciones sucesivas donde se tomó 0.1 mL de la solución previa y se enrazaron en una fiola de 10 mL para cada antibiótico. Para las diluciones se utilizó como diluyente el ácido fórmico y el acetonitrilo (en una proporción de 0.1:99.9). Las soluciones para la curva de calibración fueron soluciones mezcla de estos estándares de antibióticos, para lo cual se realizaron diluciones hasta llegar a obtener concentraciones de 10, 50, 100, 200 y 300 ppb con el diluyente de ácido fórmico y acetonitrilo. Con el fin de mantener concentraciones homogéneas de cada antibiótico en las soluciones mezcla, las soluciones fueron previamente agitadas antes de cada dilución.

 

Análisis por UHPLC-MS/MS

El análisis por espectrometría de masas se realizó con el detector del equipo UHPLC-MS/MS Acquity Xevo TQ-XS (Waters®). La optimización de los parámetros fue realizada con las soluciones estándares para sintonización y bajo una fuente de ionización de electrospray (ESI) en modo ESI positivo, permitiendo al equipo optimizar los resultados para crear el método de este grupo de 10 antibióticos. Los parámetros optimizados fueron: voltaje de capilar 3.0 kV, temperatura de la fuente 150 °C, temperatura de desolvatación 500 °C, flujo del gas de cono (N2) 20 L/h y flujo del gas desolvatación (N2) 1000 L/h. La adquisición y procesamiento de datos en el equipo UHPLC-MS/MS se realizó con el programa MassLynx 4.2. En la Tabla 1 se muestran los principales parámetros de espectrometría de masa MS/MS por cada analito determinado en el presente estudio.

 

El análisis de cromatografía se realizó en el equipo de UHPLC-MS/MS a través de la separación de los analitos con la columna de fase reversa HSS T3, 100 mm largo*2.1 mm diámetro, 1.8 µm tamaño de partículas. Para la corrida cromatográfica se utilizó como fase móvil ácido fórmico al 0.1% en agua ultrapura (Fase A) y 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo (Fase B), con un flujo de 0.5 mL/min. La gradiente de elución inició con 0 % de Fase móvil B hasta los 8 minutos, luego 100% de Fase móvil B hasta los 9.5 min al volver a 0 % de Fase móvil B hasta los 13 minutos en que culmina la corrida cromatográfica, con un tiempo de lavado para llegar al equilibrio inicial de la columna, que dura 3.4 minutos antes de la siguiente corrida. El volumen de inyección fue de 2 µL y la temperatura de la columna de 40 °C.

 

Tabla 1

Ventanas de tiempo de retención (tR) y parámetros MS/MS de los 10 analitos del estudio

Estándar /

Analito

Precursor (m/z)

Producto (m/z)

Modo de ionización

Voltaje cono (V)

Colisión (V)

Tiempo de retención (min)

Enrofloxacino

360.168

316.115

Positivo

40

20

2.55

244.929

Positivo

40

10

Ciprofloxacino

332.196

288.221

Positivo

40

25

2.39

245.143

Positivo

40

15

Ácido oxolínico

262.068

244.063

Positivo

40

15

3.45

159.967

Positivo

40

25

Amoxicilina

366.196

349.182

Positivo

40

32

1.68

113.991

Positivo

40

10

Tetraciclina

445.27

410.25

Positivo

20

18

2.52

154

Positivo

20

25

Clortetraciclina

479.332

444.15

Positivo

40

15

2.99

462.2

Positivo

40

18

Oxitetraciclina

461.24

426.21

Positivo

40

18

2.38

443.307

Positivo

40

12

Sulfadoxina

311.07

155.922

Positivo

30

30

3.18

91.989

Positivo

30

15

Sulfadimetoxin

311.132

155.983

Positivo

30

25

3.62

91.98

Positivo

30

16

Florfenicol

358.2

240.86

Positivo

25

16

3.24

205.8

Positivo

25

26

Nota. m/z (Relación de la masa molecular y el número de carga) y V (Voltaje)

 

Validación del método analítico

Para validar el método se utilizaron prioritariamente los criterios de aceptabilidad de la guía de métodos químicos del Programa de Alimentos y Medicina Veterinaria de la FDA de los Estados Unidos del 2019, en la que se requiere más de 9 muestras por nivel de concentración. En el presente estudio se utilizó 10 muestras para cada concentración analizada y se estudiaron los siguientes parámetros: Selectividad, Sensibilidad, Límite de detección, Límite de cuantificación, Recuperación (Exactitud) y Precisión (Repetibilidad y Reproducibilidad). La Tabla 2 muestra los criterios de aceptabilidad para cada uno de estos parámetros, de acuerdo a la guía de validación de la FDA (FDA, 2019).

 

Adicionalmente, guías como la IUPAC, la guía de residuos de pesticidas en alimentos (SANTE), la guía de SERNAPESCA y la guía de validación de métodos del Instituto Nacional de Salud de Chile sirvieron de orientación para los parámetros que no tenían criterio de aceptación en la guía de la FDA (Thompson et al., 2002; EURL, 2019; SERNAPESCA, 2018; Instituto de Salud Pública de Chile, 2010). Todos los parámetros analizados fueron realizados en matrices fortificadas, para minimizar el efecto matriz que pudiera existir, es decir, analizar directamente de la muestra y no de una solución mezcla.

 

Tabla 2

Parámetros de validación y sus criterios de aceptación según la FDA (2019)

Parámetro de validación

Criterios de aceptación de la FDA

0.001 mg/kg

0.01 mg/kg

0.1 mg/kg

1 mg/kg

1 ppb

10 ppb

100 ppb

1 ppm

Límite de detección

≤ 0.0002 mg/kg

≤0.002 mg/kg

≤ 0.01 mg/kg

≤ 0.1 mg/kg

Límite de cuantificación

≤ 0.0004 mg/kg

≤ 0.004 mg/kg

≤ 0.02 mg/kg

≤ 0.2 mg/kg

Desviación estándar relativa (RSDr)

≤ 22%

≤ 22%

≤ 11%

≤ 8%

Reproducibilidad

intralaboratorio (PRSDr)

≤ 22%

≤ 22%

≤ 22%

≤ 16%

Recuperación

40% - 120%

60% - 115%

80% - 110%

80% - 110%

Nota. FDA (2019, p. 23)

 

Análisis en muestras comerciales (productos disponibles en el mercado)

Las muestras de trucha para el análisis de residuos antibióticos con el método validado fueron obtenidas como truchas directas para el consumo humano en mercados de Lima Norte ubicados en los distritos de Los Olivos, Independencia, Comas, Puente Piedra y San Martín de Porres (ver Apéndice 2). Las muestras usadas para estos análisis siguieron la metodología descrita anteriormente, excepto que estas no fueron fortificadas. La secuenciación de su corrida cromatográfica se muestra en la Tabla 3.

 

Tabla 3

Secuencia de las corridas cromatográficas para cada muestra en el UHPLC-MS/MS.

Número de corrida

Muestra

Volumen

1

St 0

2 µL

2

St 1

2 µL

3

St 2

2 µL

4

St 3

2 µL

5

St 4

2 µL

6

St 5

2 µL

8

Blanco: Solución C2 (Solución de reconstitución del extracto)

2 µL

9

Extracto de la Muestra M1 (replica 1)

2 µL

10

Extracto de la Muestra M1 (replica2)

2 µL

10

Lavado débil

1200 µL

11

Lavado fuerte

400 µL

Nota. Los St son las diferentes concentraciones de la curva de calibración

 

 

Resultados

Selectividad

Este parámetro fue obtenido a través de la relación del promedio de 10 muestras fortificadas con la mezcla de antibióticos a 10 ppb y la muestra blanco. El porcentaje de la muestra blanco (MB) no debe ser mayor al 30% en comparación con el promedio de matrices fortificadas, de acuerdo a la guía de procedimientos de validación SANTE/11945/2015 (EURL, 2019). Este criterio se cumplió en todos los casos, como se muestra en la Tabla 4.

 

Tabla 4

Porcentaje del área del pico cromatográfico en la matriz blanco respecto al área del pico en la matriz fortificada del analista 1 (A1) y del analista 2 (A2) UHPLC-MS/MS

Analitos

Área de la matriz blanco (MB)

Área del pico cromatográfico 10 ppb (A1)

(n=10)

% MB

Área del pico cromatográfico

10 ppb (A2)

(n=10)

% MB

Enrofloxacino

40030.41

289700.072

13.818

292976.741

13.663

Ciprofloxacino

6078.979

96260.664

6.315

96944.0047

6.271

Ácido oxolínico

18983.387

612786.513

3.098

634306.538

2.993

Amoxicilina

70.239

14384.302

0.488

14366.9994

0.489

Tetraciclina

449.111

61627.4557

0.729

62053.4102

0.724

Clortetraciclina

54.527

14784.016

0.369

14396.8384

0.379

Oxitetraciclina

3132.725

67280.5858

4.656

68176.0651

4.595

Sulfadoxina

1328.583

168330.087

0.789

161129.138

0.825

Sulfadimetoxina

2742.832

162807.939

1.685

161115.866

1.702

Florfenicol

303.211

4224.5143

7.177

3741.7327

8.103

Criterio de aceptación

% MB < 30%

 

Linealidad

La linealidad de la curva de calibración del método fue calculada a través de la estimación lineal, utilizando el método de mínimos cuadrados. El coeficiente de determinación y el coeficiente de correlación fueron mayores a 0.994 y 0.997, respectivamente, indicando que hay una correlación lineal entre las variables x e y para cada analito y por tanto que la curva de calibración es aceptable (Lee, 2012).

Adicionalmente se realizó una regresión lineal en el software de análisis estadístico STATA 16.0, en el que se encontró un p-value < 0.05, lo que indica que existe una relación directamente proporcional entre el área del pico cromatográfico y la concentración de los residuos, con un nivel de confianza del 95%.

 

 

Sensibilidad

La sensibilidad fue obtenida de manera gráfica comparando las curvas de calibración de los 10 diferentes analitos, según se aprecia en la Figura 1. Las pendientes verticales muestran mayor sensibilidad debido a que variaciones mínimas del área bajo la curva generan una mayor respuesta a la variación de la concentración (Instituto de Salud Pública de Chile, 2010). Según este análisis, los analitos menos sensibles son el enrofloxacino y el ácido oxolínico.

 

Figura 1

Gráfica de comparación de las curvas de calibración de los 10 analitos

 


 

Límite de detección y Límite de cuantificación

Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) fueron iguales a tres veces y diez veces la desviación estándar, respectivamente, según lo especifica la IUPAC (Thompson et al., 2002). La desviación estándar se obtiene de la concentración blanco o de la mínima concentración de referencia (SERNAPESCA, 2018). Para este estudio fue de 10 matrices fortificadas a 10 ppb. El único analito que no cumplió con el límite de cuantificación fue la clortetraciclina, que excedió la cantidad que indica el criterio de aceptación de la guía de la FDA, como se muestra en la Tabla 5.

 

Tabla 5

Límite de detección y de cuantificación

N°

Analito

Desviación estándar (s)

LOD (µg/kg)

(3*s)

LOQ (µg/kg)

(10*s)

1

Enrofloxacino

0.375

1.124

3.748

2

Ciprofloxacino

0.228

0.685

2.283

3

Ac. Oxolínico

0.377

1.130

3.765

4

Amoxicilina

0.303

0.910

3.035

5

Oxitetraciclina

0.290

0.869

2.898

6

Clortetraciclina

0.665

1.994

6.647

7

Tetraciclina

0.267

0.801

2.671

8

Sulfadoxina

0.221

0.664

2.214

9

Sulfadimetoxina

0.333

0.998

3.327

10

Florfenicol

0.302

0.906

3.020

Criterio de aceptación

LOD ≤ 0.002 mg/kg o 2 µg/kg

LOQ ≤ 0.004 mg/kg o 4 µg/kg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nota. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) del método

 

Recuperación

La recuperación se realizó en 20 muestras para cada nivel de concentración, habiéndose obtenido el promedio de recuperación de cada analito en cada uno de estos niveles. El criterio de aceptación de la recuperación de acuerdo a la guía de la FDA es de 80-110% y para concentraciones menores de 100 ppb es de 60-115%. Todos los analitos se encuentran dentro del rango requerido (superior a 80%), según se muestran en la Figura 2.

 

Figura 2

Gráfica del promedio de recuperación de los 10 analitos a 3 diferentes concentraciones

Precisión

La repetibilidad es parte de la precisión ejercida bajo las mismas condiciones de análisis y fue realizada a 10 muestras por cada analista. Como se muestra en la Tabla 6, todas las muestras cumplen con el criterio de aceptación de la FDA, aunque existe una mayor variación en las muestras fortificadas a menor concentración.


Tabla 6
Repetibilidad del método según el analito

 

 

Fortificado a 10 µg/kg

Fortificado a 50 µg/kg

Fortificado a 200 µg/kg

 N°

Analitos 

Analista 1

(n=10)

Analista 2

(n=10)

Analista 1

(n=10)

Analista 2

(n=10)

Analista 1

(n=10)

Analista 2

(n=10)

1

Enrofloxacino

3.69

3.05

0.89

1.79

0.97

1.27

2

Ciprofloxacino

2.02

2.34

1.28

1.90

2.06

2.01

3

Ácido oxolinico

3.55

2.16

1.59

1.46

1.12

1.86

4

Amoxicilina

2.69

3.82

1.40

1.57

1.50

0.78

5

Tetraciclina

2.86

2.24

1.31

1.22

1.37

1.76

6

Clortetraciclina

5.95

5.50

2.69

2.03

1.38

1.44

7

Oxitetraciclina

2.32

2.86

1.46

1.45

1.36

1.93

8

Sulfadoxina

2.00

4.34

1.53

1.09

1.21

1.43

9

Sulfadimetoxina

3.03

2.35

1.15

1.81

0.90

1.03

10

Florfenicol

2.76

3.71

3.36

4.16

1.92

2.60

Criterio de aceptación

<22%

<11%

<8%

 

La reproducibilidad se muestra a través de la desviación estándar relativa de ambos analistas, apreciándose la evidente variación de precisión a 10 ppb (Figura 3). No obstante, todos los valores se mantienen dentro de los márgenes establecidos por la FDA, es decir en valores menores al 22%.

 

Figura 3

Gráfica de la reproducibilidad de los 10 analitos a 3 diferentes concentraciones

 

Análisis en muestras de mercado

En los resultados obtenidos de las muestras de mercado no se detectó presencia de los analitos del método, excepto en el caso de la oxitetraciclina, que se detectó por encima del límite de detección del método (Tabla 5), a una concentración de 1.359 µg/kg, en la muestra obtenida del mercado de Comas. El equipo de UHPLC-MS/MS obtuvo automáticamente las señales de los fragmentos o iones hija de la señal de oxitetraciclina de la muestra analizada, debido a los parámetros de identificación (ver Tabla 1), que se obtuvieron en la sintonización y que quedan registrados en el software del equipo como parte del método. En la Figura 4 se aprecia los fragmentos de la molécula de oxitetraciclina obtenida en cada réplica.

Figura 4

Cromatograma de los fragmentos de oxitetraciclina de la muestra del mercado de Comas (M4)

 

 

 

 

 

 

 

Discusión

El método evaluado demostró ser adecuado para la determinación de los residuos antibióticos estudiados. Se discute a continuación los diferentes parámetros de validación obtenidos en el presente estudio. La cromatografía liquida acoplada a un espectrómetro de masas en un equipo de UHPLC-MS/MS es un método selectivo, debido a la forma en que reconoce los fragmentos de la molécula. Al compararlo con un blanco, se pudo verificar que (i) no existe ninguna señal suficientemente fuerte que pueda ocasionar interferencia en ese mismo tiempo de retención como se aprecia en la Tabla 4 y (ii) puede separar los antibióticos a pesar de que algunos son de la misma familia química (EURL, 2019). Por otra parte, la sensibilidad y la linealidad son parámetros que se pueden evaluar por un método visual observando la tendencia de la gráfica, aunque para la linealidad es obligatorio que el coeficiente de determinación y el de correlación sean mayores a 0.99 (Instituto de Salud Pública de Chile, 2010; Lee, 2012).

En cuanto al límite de detección y de cuantificación, se observó en el presente estudio que la clortetraciclina fue el único analito que estuvo fuera del criterio de cuantificación, presentando una mayor desviación estándar. No obstante, cabe mencionar que este parámetro se puede realizar en muestra blanco, en la que la desviación estándar sería menor y probablemente cumpliría con el criterio, aunque correspondería al cálculo de una interferencia, por lo que sería preferible realizar la prueba con la desviación estándar de una concentración de referencia mínima (SERNAPESCA, 2018). Sin embargo, debe remarcarse que los resultados obtenidos en el presente estudio muestran un mejor rendimiento en comparación a otros estudios, en los que se han reportado LOQ de alrededor de 25 μg/kg y 12.5 μg/kg para los mismos analitos (Rocha et al., 2017; Pereira et al., 2012)

En cuanto a la recuperación, todos los analitos cumplieron con el criterio referencial, si bien los resultados de la concentración menor se encuentran cerca del límite, aunque dentro de los límites de la guía SANTE sugiere valores de recuperación entre 70-120% (FDA, 2019; EURL, 2019).

En cuanto a los parámetros de precisión, las mayores variaciones ocurrieron en el menor nivel de concentración, especialmente en el caso de la clortetraciclina, aunque todos los analitos cumplieron con el criterio de aceptación. La variación en las concentraciones mínimas se explica porque las diluciones son más críticas, dado que cualquier microvolumen (por ejemplo, una gota) resulta significativa en la dilución, pudiendo alterar la concentración. Estudios previos en productos acuícolas han mostrado resultados de recuperación y precisión con perfiles más variables, con recuperaciones fuera de los límites del criterio de aceptabilidad de la guía de la FDA, pero dentro de los criterios de la precisión. No obstante, en todos los casos los valores referidos a la precisión fueron mayores a los del método evaluado en el presente estudio (Rocha et al., 2017; Pereira et al., 2012; kanda et al., 2015; Fedorova et al., 2013). Los estudios más recientes, que utilizaron la metodología multiresiduos en UHPLC-MS/MS (You-Yu et al., 2018; Grande-Martínez et al., 2018; Santos et al., 2019; Li et al., 2020), han reportado valores más acordes al criterio de aceptabilidad, semejantes a los nuestros, debido a optimizaciones realizadas en el procesamiento de la muestra. No obstante, cabe remarcar que en dichos estudios se reporta todavía una mayor variabilidad en la precisión.

Se debe recalcar que, a mayor número de analitos, los resultados de las pruebas suelen ser más variables que cuando se usa un menor número de analitos. Por ende, la validación del presente método sólo tomó en cuenta los analitos que se encuentran en el procedimiento del control de residuos del ente regulador (SANIPES, 2008) y los que tienen registros sanitarios autorizados por SANIPES (Apéndice 3). Asimismo, debe mencionarse que, aunque sus criterios son parecidos, cada guía de validación tiene criterios propios. El presente estudio se basó en los criterios de la FDA para los parámetros de validación, exceptuando la selectividad, sensibilidad y linealidad, para los que no incluye criterios de aceptabilidad, por lo que se tuvo que recurrir al uso de otras guías de referencia.

 

Análisis en muestras comerciales de trucha arco iris

Los análisis en muestras de mercado se realizaron para verificar la presencia de antibióticos en productos que llegan directamente al consumidor. Si bien sólo se detectó oxitetraciclina en una concentración inferior a su límite permitido (Apéndice 3), es importante mencionar que la depuración de los medicamentos depende de condiciones del hábitat y ambientales, en relación a factores como temperatura y salinidad (Burka et al., 1997). La vida media del grupo de tetraciclinas es de 4.8 días a 16 °C y 8.9 días a 5°C (Burka et al, 1997). En el caso de la muestra con contenido de oxitetraciclina, se desconoce la zona de crianza de la trucha. No obstante, dado que la muestra fue adquirida en verano, es posible que las concentraciones de oxitetraciclina en la zona de producción sean mayores y debido al tiempo transcurrido entre la producción y comercialización, es verosímil que haya existido una degradación del analito, haciendo que se encuentre solamente trazas de oxitetraciclina en el material estudiado. Esta rápida degradación de algunos residuos veterinarios evidencia la urgente necesidad de realizar pesquisas de los productos acuícolas tanto cerca de las zonas de producción como de las de comercialización, con el fin de evaluar los procesos de asimilación y eliminación de los residuos en los productos a consumir.

Nuestros resultados indican que el análisis de analitos por cromatografía líquida con detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo (LC-MS/MS), es un método confiable para la evaluación de multiresiduos veterinarios en tejidos. Consideramos que, tras las validaciones realizadas, los próximos estudios deben enfocarse en caracterizar la vida media de los antibióticos permitidos, de acuerdo a las condiciones ambientales y socioeconómicas de la acuicultura en el país. Estudios de este tipo se han realizado en otros países de la región como Brasil, donde por ejemplo se ha estudiado el tiempo de excreción de sulfamida, demostrando que se requieren 10 días desde la última dosis administrada al pescado para obtener la concentración máxima permitida (100 μg/kg) (Nunes et al., 2018). Esta caracterización es de relevancia, considerando que la mala administración y uso de antibióticos tienen consecuencias directas sobre el ecosistema y la salud de los consumidores, generando afectaciones que pueden ir desde una simple alergia o el cambio del microbioma intestinal hasta la resistencia antibiótica (Schar, 2020).

 

Conclusiones

La validación del presente método de multiresiduos llevado a cabo en un equipo de UHPLC-MS/MS, ha mostrado que es confiable y preciso para 10 residuos comunes de antibióticos en muestras de trucha arcoíris, utilizando una extracción de varios pasos para eliminar impurezas y para aislar los analitos de la muestra. La validación también ha demostrado que la técnica podría servir incluso para una mayor cantidad de antibióticos o analitos, considerando que los resultados no se encuentran bordeando los límites del criterio de aceptación de la FDA. La validación con muestras comerciales indica la presencia de oxitetraciclina, lo que indica que, a pesar de no superar el límite máximo permitido en el producto, se requiere evaluar los tiempos de vida media y los procesos de degradación de los diferentes residuos en los productos acuícolas.

Los resultados obtenidos como parte de la validación de este método nos permiten proponerlo como una nueva herramienta que permite el análisis de multiresiduos de forma rutinaria, precisa y confiable y que puede ser usado por los organismos de control y regulación para un mejor manejo de la producción acuícola. Asimismo, el método podría probarse en otras especies o adaptarse para determinar dichos residuos en el agua de los estanques. Además, posibilita las investigaciones sobre la metabolización y el tiempo de eliminación de los antibióticos en las especies acuícolas, lo cual ayudaría a verificar o mejorar el manejo del tratamiento farmacológico de acuerdo a las condiciones nacionales. Con ello se lograría la mejora de la calidad y se garantizaría la inocuidad de los productos acuícolas para los consumidores y por consiguiente se favorecería la imagen de nuestra industria acuícola en el mercado nacional y extranjero.


Agradecimientos e información de financiamiento

Un agradecimiento especial al CITEacuícola UPCH y específicamente a su Laboratorio de Control de Calidad y Seguridad Alimentaria, en la Universidad Peruana Cayetano Heredia, por haber brindado sus instalaciones y recursos para la realización del presente estudio.


Contribución de autoría

Nathaly Hurtado, diseño de la investigación, ejecución, recopilación de la información, redacción e interpretación y revisión del manuscrito.
Diego Chirinos, diseño de la investigación, ejecución, redacción, interpretación y revisión final del manuscrito. Diana Ochoa, redacción e interpretación y revisión final del manuscrito. Yenka Flores, redacción e interpretación y revisión final del manuscrito. Luis Huicho, revisión del proyecto, redacción e interpretación y revisión final del manuscrito. Maria Rivera-Chira, promoción y gestión del proyecto, redacción e interpretación y revisión final del manuscrito.


Conflictos de interés

 Los autores declaran que no tienen conflictos de interés de ningún tipo.


Referencias

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Apéndices

 

Apéndice 1
Datos del proveedor de las muestras utilizadas en la validación del método

Nombre de la empresa

RUC

Región

Cantidad de muestras

Fecha de recepción de la muestra

INVERSIONES ROQUE HERMANOS M & M SOCIEDAD ANONIMA CERRADA

 

20600640861

Pasco

2 kg

Octubre de 2019

 

Apéndice 2
Datos de las muestras obtenidas de los diferentes mercados

Ubicación del mercado

Peso total de muestra

Fecha de la compra

Los Olivos (M1)

Aprox. 1 kg

Diciembre 2019

Independencia (M2)

Aprox. 1 kg

Diciembre 2019

Independencia (M3)

Aprox. 1 kg

Diciembre 2019

Comas (M4)

Aprox. 1 kg

Enero 2020

Puente Piedra (M5)

Aprox. 1 kg

Enero 2020

San Martin de Porres (M6)

Aprox. 1 kg

Enero 2020

 

Apéndice 3
Antibióticos con registro sanitario en SANIPES (2021) y los límites máximos de estos residuos de acuerdo al Procedimiento de Control de Sustancias y Residuos (2008)

Producto

Registro Sanitario

Principio activo

LMR

TM-700

PV-PHI004I15TM70-SANIPES

Oxitetraciclina

100 ppb

TERRIVET 80%

RSPV0006ITR

OXI-BLEND AQUA

RSPV0021IOI

DUFLOSAN 50%

PV-VET005I15DFOA-SANIPES

Florfenicol

1000 ppb

FLOR-BLEND AQUA

RSPV0004IFO

AQUAFLOR 50 %

RSPV0009IAU

ENRO-BLEND AQUA

RSPV0003IER

Enrofloxacino

100 ppb